Κεφάλαιο 4: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Ορισμοί:

Ανασυνδυασμένο DNA: Πρόκειται για τεχνητό μόριο DNA που δημιουργείται στο δοκιμαστικό σωλήνα από τη σύνδεση κομματιών DNA, τα οποία προέρχονται από δύο ή περισσότερους οργανισμούς.

Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA: Περιλαμβάνει το σύνολο των τεχνικών που οδηγούν σε μεταφορά γενετικού υλικού από έναν οργανισμό σε άλλον.

Γενετική Μηχανική: Το σύνολο των διαφορετικών βιολογικών τεχνικών, οι οποίες επιτρέπουν στον άνθρωπο να επεμβαίνει στο γενετικό υλικό των οργανισμών.

Φορέας κλωνοποίησης: Μόριο DNA, κυρίως πλασμίδιο ή βακτηριοφάγος, το οποίο χρησιμοποιείται για να μεταφέρει ένα κομμάτι DNA από ένα κύτταρο σε κάποιο άλλο.

Μετασχηματισμός: Η γενετική αλλαγή των ιδιοτήτων ενός βακτηριακού κυττάρου μετά από εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA στο γονιδίωμά του.

Κλώνος: Σύνολο πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.

Κλωνοποίηση: Η διαδικασία παραγωγής πολλών πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών.

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες: Ένζυμα που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες στο δίκλωνο DNA μήκους 4-8 ζευγών νουκλεοτιδίων, χαρακτηριστικές για το καθένα και κόβουν τους δύο κλώνους του σε συγκεκριμένες θέσεις αυτών των αλληλουχιών. Απομονώθηκαν από βακτήρια και φυσιολογικά δρουν προστατευτικά ενάντια σε κάθε ξένο DNA που εισβάλλει στα κύτταρα. Χρησιμοποιούνται ευρέως στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA.

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη: Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν όλο το DNA του οργανισμού-δότη.

Ανιχνευτής: Ιχνηθετημένο μονόκλωνο μόριο DNA ή RNA, που εντοπίζεται εύκολα με την κατάλληλη τεχνική (αυτοραδιογραφία ή φθορισμό) και χρησιμοποιείται για την απομόνωση μορίων στόχων, γονιδίων ή πρωτεϊνών.

Γονίδιο-στόχος: Το γονίδιο που μελετάται.

cDNA βιβλιοθήκη: Το σύνολο βακτηριακών κλώνων μετασχηματισμένων βακτηρίων που περιέχουν μόρια ανασυνδυασμένου DNA, τα οποία δημιουργήθηκαν από το mRNA που παράγεται σε ένα κύτταρο.

Αποδιάταξη του DNA: Καταστροφή της διπλής έλικας του DNA με διάσπαση των υδρογονικών δεσμών που συγκρατούν τις συμπληρωματικές βάσεις, η οποία προκαλείται είτε με τη θέρμανση είτε με την επίδραση σε κατάλληλο χημικό παράγοντα.

Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων: Δέσμευση ενός μορίου RNA ή DNA με ένα συμπληρωματικό μόριο DNA, το οποίο ακολουθεί τους κανόνες συμπληρωματικότητας των βάσεων.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR): Μέθοδος αντιγραφής ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA in vitro, μέσω διαδοχικών κύκλων.

🔗 Διαφορές γονοδιωματικής και cDNA βιβλιοθήκης 🔗 

Προσοχή στις λεπτομέρειες!

• Κάθε περιοριστική ενδονουκλεάση σε μία θέση αναγνώρισης προκαλεί τη διάσπαση δύο φωσφοδιεστερικών δεσμών.

• Ένα πλασμίδιο δεν μπορεί να ενσωματώσει πάνω από ένα κομμάτι ξένου DNA.

• Ένα βακτήριο δεν μπορεί να μετασχηματιστεί με πάνω από ένα ανασυνδυασμένα πλασμίδια.

• Τα βακτήρια μετά την ειδική κατεργασία με την οποία αυξάνεται η ικανότητά τους να δέχονται βιολογικά μακρομόρια μπορεί να περιέχουν ανασυνδυασμένα πλασμίδια, μη ανασυνδυασμένα πλασμίδια (έγιναν κυκλικά χωρίς να παραλάβουν ξένο DNA), αλλά και να μην περιέχουν καθόλου πλασμίδια.

•  Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μέθοδος κλωνοποίησης ενός κομματιού DNA.

• Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν δίκλωνα τμήματα DNA και κόβουν σε καθορισμένες θέσεις. Το πόσο εύκολα ή δύσκολα θα αποδιαταχθούν οι δύο αλυσίδες του DNA εξαρτάται άμεσα από το πλήθος των δεσμών υδρογόνου που σχηματίζουν. Όσα περισσότερα ζεύγη G-C διαθέτουν τόσο περισσότεροι δεσμοί θα χρειαστεί να σπάσουν (εννοείται σε σύγκριση μεταξύ δύο τμημάτων που έχουν το ίδιο μήκος).

• Το μιτοχονδριακό DNA δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φορέας κλωνοποίησης, καθώς, αν και συνήθως είναι μικρά κυκλικά μόρια, αντιγράφονται ανεξάρτητα και μπορεί να διαθέτουν μία μόνο φορά τη θέση αναγνώρισης για μία περιοριστική ενδονουκλεάση, δε διαθέτουν γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Η μη ύπαρξη αυτών των γονιδίων θα καταστήσει δύσκολη την επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων. • Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή μίας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες και η DNA δεσμάση.

• Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην κατασκευή μίας cDNA βιβλιοθήκης είναι η αντίστροφη μεταγραφάση, η DNA πολυμεράση, οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες και η DNA δεσμάση.

ΛΥΣΗ ΑΣΚΗΣΗΣ 12 ΣΧΟΛΙΚΟΥ ΒΙΒΛΙΟΥ:

Μετά τις προσπάθειες μετασχηματισμού θα έχουν δημιουργηθεί τρεις ομάδες κυττάρων Ε. coli :

α) Όσα δέχτηκαν το πλασμίδιο που περιέχει το ανασυνδυασμένο DNA. Αυτά θα έχουν αντοχή μόνο στη στρεπτομυκίνη, γιατί το γονίδιο της αμπικιλίνης θα έχει καταστραφεί, λόγω της παρεμβολής του ξένου DNA.

β) Όσα δέχτηκαν το πλασμίδιο στο οποίο δεν έτυχε να ενσωματωθεί ξένο DNA. Αυτά θα έχουν αντοχή και στα δύο αντιβιοτικά.

γ) Όσα δε δέχτηκαν το πλασμίδιο, αφού δεν επιτυγχάνει 100% η διαδικασία μετασχηματισμού. Αυτά δεν έχουν αντοχή ούτε στην αμπικιλίνη ούτε στη στρεπτομυκίνη.

Για να επιλέξουμε τα ανασυνδυασμένα βακτήρια, πρώτα τα καλλιεργούμε με παρουσία στρεπτομυκίνης. Έτσι μένουν μόνο όσα έχουν δεχτεί το πλασμίδιο. Από αυτά διαλέγουμε κάποια και τα καλλιεργούμε το καθένα μεμονωμένο. Για καθένα από αυτά χωρίζουμε το πλήθος των απογόνων τους σε δύο ίσα μέρη. Στο ένα από τα δύο μέρη χορηγούμε αμπικιλίνη. Αν πεθάνουν οι απόγονοι του ενός μέρους, καταλαβαίνουμε ότι οι αδελφοί τους είναι αυτοί που έχουν μετασχηματιστεί με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.

Εντοπισμός των βακτηρίων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μπορεί να γίνει και με ανιχνευτή για το DNA που προσπαθήσαμε να εισαγάγουμε, μέσω του πλασμιδίου, στο βακτήριο Ε. coli.